Біосинтез целюлози. Синтез сахарози і полісахаридів Текст наукової роботи на тему «Біосинтез бактеріальної целюлози культурою Мedusomyces gisevii»

Клітинна стінка утворюється в результаті розвитку серединної пластинки. Відразу після повного поділу ядра рослинної клітини в телофазе мітозу поперек ділиться клітини утворюється фрагмопласт.Він складається з безлічі сплощених мембранних везикул - фрагмосом,містять компоненти клітинної стінки. У їх побудові бере участь цитоскелет. Все полісахариди клітинної стінки, за винятком целюлози, синтезуються в апараті Гольд-жи. Вони упаковуються в везикули, які транспортуються до зростаючої

серединної платівці і зливаються з нею. Серединна пластинка збільшується в напрямку до плазмалемме і з'єднується з нею, розділяючи дві дочірні клітини. Нарешті, знову утворюється клітинна стінка з'єднується з уже існуючою первинної клітинної стінкою.

Практично всі «нецелюлозний» компоненти клітинної стінки - полісахариди, структурні білки, широкий спектр ферментів - утворюються в апараті Гольджі і в його везикулах координовано направляються до клітинної стінки.

До сих пір не ідентифіковані гени, що кодують полісахарідсінтази, які беруть участь в синтезі основних ланцюгів «нецелюлозний» полімерів. Ідентифіковано гени декількох фукозіл- і галактозілтрансфераз, які приєднують окремі цукру до головної ланцюжку.

Єдиними полімерами, які синтезуються з зовнішньої сторони плазмалемми, є целюлоза і каллоза. Доцільність цього стає очевидною, якщо взяти до уваги велику довжину утворюються микрофибрилл целюлози і необхідність їх філігранної укладання в клітинну стінку. Каллоза відрізняється від целюлози наявністю β 1 → 3-D-глюкан-вих ланцюжків, які можуть утворювати спіральні дуплекси і триплекси. Каллоза утворюється в декількох типах клітин на певних стадіях формування клітинної стінки, наприклад в проростає пилкової трубці або серединної платівці клітин, які діляться. Каллоза може також синтезуватися при стрес-реакціях або у відповіді на грибну інфекцію.

Синтез целюлози каталізується мультімерной комплексами ферментів, розташованими на кінцях подовжуються микрофибрилл целюлози. Ці термінальні комплекси добре помітні під електронним мікроскопом.

Мал. 1.30. Схема будови і роботи целлюлозосінтази

У деяких морських водоростях термінальні комплекси синтезу целюлози розташовані лінійно; у всіх покритонасінних рослин вони формують розеткові структури. Термінальні комплекси з'являються в мембрані плазмалемми в момент активації синтезу целюлози.

Вихідним субстратом для целлюлозосінтази є УДФ-глюкоза. Вона утворюється за допомогою ферменту сахарозосинтази безпосередньо з сахарози. Ряд изоформ цього ферменту знаходяться в плазматичній мембрані. Постачається з відповідною целлюлозосінтазой і можуть поставляти УДФ-глюкозу безпосередньо до її каталітичного центру (рис. 1.30).

Відносно недавно були ідентифіковані декілька рослинних генів, що кодують ферменти синтезу целюлози, зокрема гени CesA, які інтенсивно експресуються в бавовняних волокнах під час активного синтезу целюлози вторинної клітинної стінки. Кодуються цими генами поліпептиди мають вісім трансмембранних доменів і масу близько 110 кДа. Відкриття генів CesA дало можливість ідентифікувати ряд інших генів, що кодують синтази полісахаридів клітинної стінки.

У рослинах в процесі фотосинтезу утворюються не тільки фосфорні ефіри цукрів або прості цукри, але і більш складні форми вуглеводів - сахароза, крохмаль, клітковина. Розпад складних форм вуглеводів до простих протікає теж дуже швидко. Це спостерігається, наприклад, при проростанні насіння, старінні вегетативних органів і ін. Утворені при розпаді прості цукри або їх фосфорні ефіри оттекают в репродуктивні органи, де з них знову синтезуються складні вуглеводи. І, нарешті, в рослинах дуже легко йдуть процеси взаємних перетворень вуглеводів.

Взаємоперетворенням моносахаридів проходить через фосфорні ефіри цукрів або їх урідіндіфосфатпроізводние (УДФ-похідні). УДФ-похідні цукрів є той чи інший цукор, з'єднаний через два залишку фосфорної кислоти з уридин, наприклад:

Рис.1. урідіндіфосфатглюкози

синтез сахарози

Сахароза є найбільш важливим з утворюються в рослинах лігосахарідов, в формі якого пов'язаний вуглець і енергія транспортуються по всій рослині. Вона складається з α-D-глюкозного залишку в його пиранозной формі, пов'язаного гликозидной зв'язком з β-D-фруктозою в фуранозной формі. Оскільки аномерного вуглецевий атом обох моносахаридів бере участь в утворенні гликозидной зв'язку, їх полуацетальние групи заблоковані і жодне з кілець не може відкритися. Таким чином, сахароза - це невідновлюючий цукор (не відновлює реактиви Фелінга і Бенедикта), і за винятком її надзвичайну чутливість до кислотного гідролізу, вона хімічно інертна. При нагріванні з кислотами, або під дією сахарази (інвертази) сахароза гідролізується, утворюючи інвертний цукор - суміш глюкози і фруктози. Сахароза добре розчиняється у воді і має солодкий смак.

Сахароза використовується як продукт харчування, а також у виробництві поверхнево-активних речовин (ефіри сахарози з вищими кислотами). Основним джерелом отримання сахарози є цукровий буряк, що містить до 23% сахарози, і цукрова тростина, стьоб-ли якого містять 10-18% сахарози. В даний час встановлено, що сахароза синтезується не тільки в хлоропластах, а й в цитоплазмі Фотосинтезуючі-чих клітин з УДФ-глюкози і фруктозо-6-фосфату, який виник з
дігідроксіацетонфосфата. Ця речовина утворюється при фотосинтезі в хлоропластах і потім надходить в цитоплазму. У нефотосинтезирующих тканинах (наприклад, в ендоспермі проростають бобів рицини) освіту сахарози з УДФ-глюкози і фруктозо-6-фосфату також відбувається в цитоплазмі клітин.

Сахароза (тростинний, буряковий цукор) - найпоширеніший в природі дисахарид. У рослинах він утворюється з глюкози і фруктози. На першому етапі йде фосфорилирование глюкози:

Глюкоза + АТФ → глюкоза-6-фосфат + АДФ,

потім глюкозо-6-фосфат ізолюється в глюкозо-1-фосфат. Глюкозо-1-фосфат з'єднується з УТФ, в результаті чого відщеплюється пірофосфатная кислота і утворюється з'єднання глюкози з урідіндіфосфорной кислотою (УДФ) - урідіндіфосфатглюкози.

Одночасно йде фосфорилирование фруктози під дією ферменту фруктокінази за участю АТФ:

фруктоза + АТФ → фруктозо-6-фосфат + АДФ.

Після цього відбувається взаємодія УДФ-глюкози з фруктозо-6-фосфатом за участю ферменту сахарозофосфат-УДФ-глюкозілтрансферази. Нарешті, що утворився сахарозо-6-фосфат під дією ферменту фосфатази гідролізується з утворенням вільної сахарози. Таким чином, для біосинтезу однієї молекули сахарози необхідні 3 макроергічні фосфатні зв'язки, ця реакція необоротна. У нефотосинтезирующих тканинах деяких рослин, наприклад, в коренеплодах цукрових буряків, бульбах картоплі та інших сахароза може утворитися з вільної фруктози:

УДФ-глюкоза + фруктоза ↔ сахароза + УДФ.

Реакція каталізується ферментом сахарозо-УДФ-глюкозілтрансферазой і в залежності від умов може бути спрямована як у бік синтезу, так і в бік розщеплення сахарози.

синтез крохмалю

Крохмаль - запасний полісахарид рослин, причому він може зберігатися в рослині довго, або витрачатися досить швидко. На тривалий час він запасається в багатьох насінні, бульбах і кореневищах і використовується тільки тоді, коли ці органи проростають. На короткий час крохмаль утворюється в хлоропластах в період швидкого фотосинтезу, а в наступний темновой період він витрачається і відтікає з листя в формі сахарози. Крохмаль завжди утворюється і запасається у вигляді крохмальних зерен, що знаходяться в пластидах - хлоропластах або амилопластах. Крохмальні зерна - це високоорганізовані структури, форма і розмір яких дуже різноманітні, але часто характерні для даного виду рослини. Форма зерен може бути сферичної, яйцеподібної, чечевицеобразного або неправильної; розмір може коливатися 1 до 100 мкм. Найбільші крохмальні зерна у картоплі, а найдрібніші у рису і гречки. Крохмальні зерна містять до 20% води (у тому числі 10% хімічно пов'язане з крохмалем) і ряду концентричних шарів крохмалю. Крохмальні зерна утворюються шляхом нашарування новостворених шарів на раніше існуючі.

Зміст мінеральних речовин в крохмалі дуже невелика - 0,2-0,7%, вони представлені в основному фосфорною кислотою. У крохмалі знайдені деякі високомолекулярні жирні кислоти (пальмітинова, стеаринова та ін.), Зміст яких досягає 0,6%. Крохмаль є сумішшю двох полісахаридів - амілози і амілопектину. Молекули амілози - це довгі нерозгалужені ланцюги, що містять від 100 до кількох тисяч глюкопіранозних залишків, з'єднаних глікозіднимі зв'язками. Вивчення дифракції рентгенівських променів показало, що молекули амілози мають спиралевидную структуру діаметром 1,3 нм з шістьма послідовними глюкозні залишками на один оборот спіралі.

Молекули амілози розчинні в гарячій воді, але утворюється розчин нестійкий і потім відбувається спонтанне осадження амілози, відоме як ретроградація. Це відбувається внаслідок тенденції довгих і тонких амілозних молекул вибудовуватися в лінію поруч один з одним і утворювати нерозчинні агрегати за допомогою водневих зв'язків. Донором глюкозних залишків при біосинтезі амілози може служити урідіндіфосфатглюкоза- (УДФК). Для її утворення в реакційній середовищі необхідна наявність затравки, в якості якої можуть служити полісахариди, побудовані лише з 3-4 залишків глюкози, з'єднаних α (1-4) -зв'язків.

Залишки глюкози переносяться на акцептор (затравки), де і відбувається подовження ланцюга. Реакція йде за схемою:

УДФГ + акцептор (Г) до - УДФ + акцептор (Г) до + 1,

де Г - залишки глюкози.

Фермент, що каталізує цю реакцію, називається УДФГ-крахмалглюкозілтрансферазой.

У більшості рослин активним донором глюкози є не УДФ-глюкоза, а аденозіндіфосфатглкжозα (АДФГ). Реакція приєднання глюкозних залишків від АДФГ до низькомолекулярних акцептору йде аналогічним шляхом і каталізується ферментом АДФГ-крохмаль-глюкозілтрансферазой. Синтез розгалуженої молекули амілопектину, що має α (1-6)-зв'язку, відбувається за допомогою ферменту α-глюкантрансферази (Q-фермент). У синтезі крохмалю беруть участь і Д-фермент або глюкозілтрансфераза, який утворює α (1-4)-зв'язку і бере участь в утворенні затравки.

Розпад крохмалю відбувається за участю двох процесів - гідролізу і фосфороліза.Гідролітіческій розпад крохмалю здійснюється під дією чотирьох ферментів класу гідроліз α-амілаза, каталізує розщеплення α (1-4)-зв'язку, причому зв'язку розриваються безладно. Кінцевий продукт такого розпаду - мальтоза, глюкоза, декстрини. Під дією β-амілази відбувається розщеплення α (1-4) -зв'язків з утворенням залишків мальтози. Фермент глюкоамілази каталізує послідовне відщеплення залишків глюкози від молекули крохмалю. Амілопектин-1,6-глюкозидази або R-фермент каталізує розщеплення α (1-6) -зв'язків в молекулі амілопектину, т. Е. Діє на точки розгалуження.

Фосфороліз - це приєднання фосфорної кислоти за місцем розриву глюкозидной зв'язку між залишками моносахаридів в ланцюзі полісахариду, при цьому відбувається утворення глюкозо-1-фосфату. Ця реакція каталізується ферментомаглюконфосфорілазой, що належать до класу трансфераз. Крохмаль в рослині може піддаватися дуже швидкого розпаду, так як ферменти розпаду знаходяться у всіх органах рослини.

синтез целюлози

Целюлоза не розчинна у воді, вона лише набухає в ній. При кислотному гідролізі (кип'ятіння в сірчаної кислоти) перетворюється в глюкозу, при більш слабкому - в целлобіоза. За допомогою рентгеноструктурного аналізу встановлено, що молекула целюлози має ниткоподібну форму. Ці ниткоподібні молекули, завдяки водневим зв'язкам, з'єднуються пучками по 40-60 штук в міцелу. У клітинних стінках рослин міцели целюлози пов'язані по-огрядними зв'язками з різними гетерополісахарид. Наприклад, у білого клена ними є з'єднані між собою Глікозидний зв'язками ксілоглюкан, арабіногалактан, рамногалактурон. Крім того, є дані про те, що в побудові клітинної стінки рослин бере участь особливий, багатий оксипролина гликопротеид екстензін.

Целюлоза побудована із залишків β-глюкози. У біосинтезі целюлози бере участь не вільна глюкоза, а її ГДФ-похідне - гуанозіндіфосфатглюкоза за участю ферменту целлюлозосінтетази за схемою:

ГДФ - глюкоза + (глюкоза) до → ГДФ + (глюкоза) до + 1

Розпад целюлози йде переважно гидролитическим шляхом під дією ферменту целюлази до дисахарида целлобіози.

Транспорт вуглеводів здійснюється у вигляді сахарози. В процесі фотосинтезу утворюється багато вуглеводів, і в зв'язку з цим велике значення має відтік асимілятів в інші частини клітини з хлоропластів. Проникнення через мембрану хлоропластів фосфорілірованний гексоз і сахарози утруднено, найбільш легко через мембрани хлоропластів проникають тріозофосфати (ФГА і ФДА). Передбачається, що утворюються складні вуглеводи розпадаються на тріозофосфати і в такому вигляді пересуваються в цитоплазму, де можуть служити матеріалом для ресинтезу гексоз, сахарози, крохмалю.

Міжклітинний Паренхімні транспорт здійснюється двома шляхами - по плазмодесмам (симпласти) або по вільному простору (аппопласту). Сахароза, що утворилася в клітинах мезофіла листа, десорбується в аппопласт. Виходячи з паренхімних клітин в аппопласт, сахароза розщеплюється інвертазу на гексози. Гексози пересуваються по аппопласту до передавальних клітинам провідних пучків по градієнту концентрацій. При зіткненні з передавальними клітинами флоеми вони знову перетворюються в сахарозу. Далі відбувається завантаження сітовідних трубок, сахароза надходить проти градієнтаконцентрацій, і потрібно витрата енергії (АТФ).

Передбачається, що сахароза долає мембрану за допомогою переносника в комплексі з протоном. При цьому завдяки роботі Н + -АТФ-ази іони Н + викачуються з клітин флоеми, а потім надходять назад по градієнту рН, захоплюючи за собою сахарозу проти градієнта її концентрації. Основною транспортною формою вуглеводів по флоеме служить сахароза (С 12 Н 22 Про 11). У деяких видів поряд з сахарозою транспортною формою вуглеводів служать олигосахара (рафіноза, стахиоза), а також деякі спирти.



У циклі Кальвіна - Бенсона утворюється, як уже зазначалося вище, фруктозо-6-фосфат (F-6-P). Цей гексозофосфат може під дією специфічних ферментів перетворюватися в інші фосфорильовані гексози, а саме в глюкозо-6-фосфат (G-6-P) і глюкозо-1-фосфат (G-1-P). Легко відбувається і зворотне перетворення.

З цих трьох гексозофосфат будуються потім ланцюги вуглеводних молекул, використовуваних для транспорту, зберігання і в реакціях синтезу. Щоб такі перетворення могли відбутися, гексозофосфат попередньо повинні бути активовані. Це зазвичай досягається в результаті їх приєднання до нуклеотидам - \u200b\u200bскладним кільцевим структурам, подібним з адениловой кислотою АТР. Продуктом такої реакції приєднання виявляються нуклеотидні похідні моносахаридів, або нуклеотідсахара. Частіше за інших зустрічаються урідіндіфосфоглюкоза (UDPG), що утворюється в реакції між урідінтріфосфатом (UTP) і глюкозо-1-фосфатом (G-1-P). Сам UTP утворюється непрямим шляхом, в результаті перенесення фосфатної групи від АТР до UDP (уридиндифосфат).

Нуклеотиди АТР і UTP присутні у всіх клітинах, тому що вони використовуються поряд з іншими нуклеотидами в синтезі ДНК і РНК.

Сахара транспортуються по рослині у вигляді сахарози - дисахарида, що складається із залишків глюкози і фруктози (рис. 5.2). Сахароза утворюється в реакції між UDPG і F-6-P:

Рівновага цієї реакції сильно зрушено в бік синтезу сахарози, чим забезпечується можливість накопичення даного дисахарида в значних концентраціях. Для подальшого використання сахароза повинна попередньо піддатися розщепленню: фермент інвертаза каталізує її гідроліз з утворенням вільної глюкози і фруктози.

Енергія гликозидной зв'язку в такій реакції витрачається даремно, розподіляючись між двома молекулами. Тому якщо глюкози і фруктози належить розпад в процесі дихання або участь (в якості сировини) в синтезі полісахаридів, то вони повинні попередньо знову піддатися фосфорілірова- нию за рахунок АТР. Процеси синтезу і розпаду сахарози наочно показують, що часто анаболічні і катаболические реакції (реакції синтезу і розпаду) ідуть по різних шляхах.

Синтез крохмалю і целюлози

Довгі полімерні ланцюги крохмалю і целюлози побудовані з одних і тих же елементарних ланок - залишків глюкози, тільки з'єднаних по-різному. Цей структурний відмінність обумовлює те, що два розглянутих полімеру глюкози (глюкан) істотно розрізняються за своєю природою; крохмаль, наприклад, легко перетравлюється в організмі людини "а целюлоза зовсім не перетравлюється. Головне ж їх відмінність полягає в тому, що 1-й і 4-й вуглецеві атоми двох сусідніх залишків глюкози з'єднані у крохмалю α-зв'язками, а у целюлози (β -зв'язків (рис. 5.3). Крохмаль представлений двома формами: лінійним полімером, або амилоза, що не містить ніяких інших зв'язків, крім α-1,4-глікозидних, і розгалуженим полімером, або амілопектину, в якому поряд з α-1,4 -глікозидними зв'язками є і 1,6-зв'язку. Різниця в характері зв'язків визначає і неоднакове просторове розташування полімерних ланцюгів. Крохмаль - головний запасний полісахарид рослини. Він не розчиняється у воді і відкладається шар за шаром в крохмальних зернах, що містяться в хлоропластах (див. рис . 2.20) або в позбавлених хлорофілу лейкопластах запасающих тканин стебла, коренів і насіння. Іноді клітини запасающей тканини виявляються буквально забиті крохмальними зернами, які легко в них виявити, оскільки вони здатні пофарбовані тися йодом в синій колір. Будучи не розчиняється у воді, крохмаль на відміну від сахарози і від гексоз не викликає в клітинах осмотичного ефекту (див. Гл. 6). Тому освіту крохмалю в клітинах листа в періоди інтенсивного фотосинтезу запобігає придушення останнього, що відбувається в результаті накопичення продуктів фотосинтезу. У темряві крохмаль поступово знову гідролізується з утворенням глюкозофосфата, який потім перетворюється в сахарозу, що транспортується в інші частини рослини.

Мал. 5.3. Структура крохмалю (А) і целюлози (Б) (Із змінами по J. Bonner, AW Galston. 1952. Principles of Plant Physiology, San Francisco, WH Freeman and Co.) Зверніть увагу, що хімічні формули крохмалю і целюлози однакові, різняться ж ці полісахариди просторової орієнтацією їх кисневих містків. А. Крохмаль, головний запасний полісахарид рослини, побудований з двох добре помітних компонентів: амілози з її довгими нерозгалужених ланцюгами з глюкозних ланок і амілопектину, що складається з великого числа коротких розгалужених ланцюгів. Б. Целюлоза, головний компонент первинної клітинної стінки, існує у вигляді довгих полімерних ланцюгів. Ланцюги об'єднуються в міцелярні тяжі, а останні - в мікрофібрили. Мікрофібрили, досить великі для того, щоб їх можна було розглянути за допомогою електронного мікроскопа, складають "основу" і "качок" клітинної стінки

Вихідним продуктом для синтезу крохмалю служить аденозіндіфосфоглюкоза (ADPG), що утворюється з АТР і G-1-P:

Молекула крохмалю будується шляхом поступового додавання одного глюкозного залишку за іншим в реакції ADPG з предобразованной глюкозной ланцюгом:

При низькому вмісті сахарози крохмаль розщеплюється і. перекладається в сахарозу. Однак спочатку він розщеплюється до залишків глюкози і до кожного з них приєднується залишок фосфорної кислоти, т. Е. Утворюється G-1-P, чим забезпечується збереження енергії зв'язку:

Цей G-1-P може потім використовуватися для синтезу сахарози, який ми описали вище. У насінні і в деяких інших органах, в яких одночасно йде розщеплення великих кількостей крохмалю, він розпадається до дисахарида мальтози (G-G) під дією аα-амілази. Мальтоза потім розпадається до глюкози, з якої (для транспорту) знову синтезується сахароза. На цьому другому шляху на відміну від першого енергія зв'язку не зберігається, тому тут для перетворення глюкози в глюкозо-6-P потрібно АТР.

Целюлоза, найпоширеніший на Землі вуглевод, служить головним компонентом первинної клітинної стінки. Молекули її будуються подібно до того, як будуються молекули крохмалю, з тим, оцнако, відмінністю, що роль донора глюкози грає інше нуклеотидное похідне моносахарида - гуанозін- діфосфоглюкоза (GDPG) - і що зв'язок між мономернимі.звеньямі належить не до α-, а до β-типу.

У деяких випадках донором глюкози для синтезу целюлози може бути і UDPG.

В організмі вищих рослин целюлоза розщеплюється рідко (якщо не брати до уваги розпаду, обумовленого діяльністю мікробів). Два відомих виключення з цього правила стосуються клітин в видільної зоні листа, що утворюється перед скиданням листя, і судин ксилеми, у яких поперечні стінки розчиняються. У видільної зоні листа фермент целлюлаза руйнує клітинні стінки, розщеплюючи міститься в них целюлозу до окремих мономірних одиниць, т. Е. До глюкози. Клітинні стінки, ослаблені цим процесом, в кінці кінців розриваються, і лист скидається.

Целюлозні мікрофібрили в клітинній стінці скріплені за допомогою матриксу зі змішаних полісахаридних ланцюгів, головним чином ксілоглюканов і арабіногалактанов (див. Рис. 2.31). (Ксилоза і арабиноза - пятиуглеродного цукру (пентози), а галактоза - гексоза, споріднена глюкози.) Ці полісахариди синтезуються також з попередників, нуклео- тідсахаров, переважно в діктіосоми. Отшнуровиваться від диктиосом бульбашки в кінці кінців зливаються з плазмалеммой і таким шляхом передають свій вміст формується клітинної стінки.

Отже, все полісахариди легко переходять один в інший, але синтез їх завжди йде через стадію нуклеотідсахаров, тоді як розпад відбувається більш прямим шляхом.

У більшості продуктів рослинного походження містяться так звані баластні речовини, що не перетравлюються в шлунково-кишковому тракті, - клітковина і пектин. Однак вони необхідні людині. Якщо їжа бідна ними, виникають атонія кишечника і запори. Таким чином, клітковина є регулятором рухової функції кишечника.

Клітковина поліпшує роботу кишечника, уповільнює гнильні процеси і газоутворення, зменшує всмоктування деяких шкідливих речовин. Так, наприклад, для профілактики професійних захворювань у працюючих з солями металів і з радіоактивними речовинами рекомендується вживати в їжу червону смородину, яка містить багато пектинів.

Полісахарид: Клітковина

Клітковина (целюлоза) - полісахарид, що становить головну масу клітинних стінок рослин. Клітковина нерозчинна у воді, вона лише набухає в ній. Клітковина становить понад 50% деревини. У волокнах бавовни вона становить понад 90%. При кип'ятінні з міцною сірчаною кислотою клітковина без остачі перетворюється в глюкозу. При більш слабкому гідролізі з клітковини виходить целлобиоза.

У молекулі клітковини залишки целлобіози пов'язані Глікозидний зв'язками у вигляді довгого ланцюжка. Молекулярна маса клітковини точно не встановлена. Вважають, що клітковина не є індивідуальним речовиною, а являє собою суміш гомологічних речовин. Молекулярні маси клітковини, отриманої з різних джерел, досить сильно коливаються: бавовна - 330 000 (в ланцюжку 2020 глікозидних залишків); рами - 430 000 (2660 залишків), ялинова деревина - 220 000 (1 360 залишків). За допомогою рентгеноструктурного аналізу встановлено, що молекули клітковини мають ниткоподібну форму. Ці ниткоподібні молекули з'єднуються в пучки - міцели. Кожна міцела складається приблизно з 40-60 молекул клітковини.

З'єднання окремих молекул клітковини в міцели відбувається завдяки водневим зв'язкам, які здійснюються як за рахунок водневих атомів гідроксильних груп клітковини, так і за рахунок адсорбованих клітковиною молекул води. У клітинних стінках рослин міцели клітковини пов'язані водневими зв'язками з різними гетерополісахарид. Наприклад, у білого клена ними є з'єднані між собою Глікозидний зв'язками ксілоглюкан, що складається із залишків глюкози, ксилози, галактози і фукоза; арабіногалактан, побудований із залишків Арабіноза і галактози; рамногалактуронан, утворений залишками галактуроновой кислоти і рамнози. Крім того, є дані про те, що в побудові клітинної стінки рослин, особливо на ранніх етапах її освіти, бере участь також особливий, багатий оксипролина гликопротеид екстензін. При Одеревіння клітинних стінок в них накопичується також лігнін.

Клітковина не перетравлюється в шлунково-кишковому тракті людини. Вона, перетравлюється лише жуйними тваринами, в шлунку яких є особливі бактерії, що гідролізують клітковину за допомогою виділяється ними ферменту целллюлази.

Геміцелюлози (полуклетчаткі). Під цією назвою об'єднують велику групу високомолекулярних полісахаридів, що не розчиняються у воді, але розчинних в лужних розчинах. Геміцелюлози містяться в значній кількості в здерев'янілих частинах рослин: соломі, насінні, горіхах, деревині, кукурудзяних качанах. Велика кількість гемицеллюлоз міститься у висівках. Геміцелюлози гідролізуються кислотами легше, ніж клітковина. При цьому вони утворюють манозу, галактозу, арабинозу або ксилозу і тому відповідно носять назви - маннани, галактани і пентозани (Арабан або ксілан).

1

Вивчено процес біосинтезу бактеріальної целюлози (БЦ) на ферментативном гидролизате лігноцелюлозної матеріалу міскантусу. Лігноцелюлозних матеріал отриманий обробкою міскантусу розведеним розчином азотної кислоти на дослідному виробництві. Ферментативний гідроліз здійснений в ферментере об'ємом 11 л. Біосинтез БЦ проведений за допомогою симбиотической культури Мedusomyces gisevii Sa-12. Встановлено, що чисельність оцтовокислих бактерій в процесі культивування в 1,2 рази менше, ніж дріжджів. Основна утилізація субстрату відбувається за 6 діб культивування, константа утилізації субстрату становить 0,234 сут-1. Показано, що ферментативний гідролізат лігноцелюлозної матеріалу міскантусу не є доброякісною живильним середовищем для біосинтезу БЦ, вихід БЦ склав 5,6%, що в 1,6 разів менше, ніж вихід на синтетичній живильному середовищі. Встановлено, що бактеріальна целюлоза, отримана на даному середовищі, є хімічно чистої.

бактеріальна целюлоза

Мedusomyces gisevii

інфрачервона спектроскопія

ферментативний гідролізат

міскантус

1. Бактеріальна целюлоза, синтезируемая Gluconacetobacter hansenii, для використання в медицині / Т.І. Громових і [ін.] // Прикладна біохімія та мікробіологія. - 2017. - Т. 53, № 1. - С. 69-75.

2. Перспективи застосування бактеріальної целюлози в м'ясопродуктах / Т.І. Громових і [ін.] // М'ясна Індустрія. - 2013. - № 4. - C. 32-35.

3. Octave S. Biorefinery: toward an industrial metabolism / S. Octave, D. Thomas // Biochimie. - 2009. - № 91. - P. 659-664.

4. Gismatulina Y.A., Budaeva V.V., Sakovich G.V., Veprev S.G., Shumny V.K. Cellulose from various parts of soranovskii miscanthus // Russian Journal of Genetics: Applied Research. - 2015. - Vol. 5, № 1. - Р. 60-68.

5. Гісматуліна Ю.А. Порівняння фізико-хімічних властивостей целюлози, отриманих комбінованим способом з листа і стебла міскантусу / Ю.А. Гісматуліна / Вісник алтайської науки. - 2014. - № 1 (19). - С. 302-307.

6. Макарова Є.І. Біоконверсія нехарчового целюлозовмістні сировини: енергетичних рослин та відходів АПК: дис. ... канд. техніч. наук. - Щелково, 2015. - 161 с.

7. Гладишева Є.К. Особливості структурних характеристик бактеріальної целюлози, синтезованої на ферментативном гидролизате лігноцелюлозної матеріалу плодових оболонок вівса / Є.К. Гладишева, Е.А. Скиба, Л.А. Альошина // ползуновского вісник. - 2016. - № 4-1. - С. 152-156.

8. Skiba E.A., Budaeva V.V., Baibakova O.V., Udoratina E.V., Shakhmatov E.G., Shcherbakova T.P., Kuchin A.V., Sakovich G.V. Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Materials in Aqueous Media and the Subsequent Microbiological Synthesis of Bioethanol // Catalysis in Industry. - 2016. - Vol. 8, № 2. - Р. 168-175.

9. Cкіба Е.А. Методика визначення біологічної доброякісності гідролізатів з целюлозовмістні сировини за допомогою штаму Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-+1693 / Е.А. Cкіба // Известия вузів. Прикладна хімія і біотехнологія. - 2016. - № 1 (16). - С. 34-44.

10. Гладишева Є.К. Біосинтез бактеріальної целюлози культурою Мedusomyces gisevii / Є.К. Гладишева, Е.А. Скиба // Вісник Воронезького державного університету інженерних технологій. - 2015. - № 3. - С. 149-156.

11. Гладишева Є.К. Дослідження впливу температури на синтез бактеріальної целюлози продуцентом Мedusomyces gisevii / Є.К. Гладишева // Сучасні наукомісткі технології. - 2016. - № 8-1. - С. 36-40.

12. Юркевич Д.І. Медузоміцет (Чайний гриб): наукова історія, склад, особливості фізіології і метаболізму / Д.І. Юркевич, В.П. Кутишенко // Біофізика. - 2002. - № 6. - С. 1116-1129.

13. Yang, X.-Y., Huang C., Guo H.-J., Xiong L., Li Y.-Y., Zhang H.-R., Chen X.-D. Bioconversion of elephant grass (Pennisetum purpureum) acid hydrolysate to bacterial cellulose by Gluconacetobacter xylinus // Journal of Applied Microbiology. - 2013. - № 115. - Р. 995-1002.

14. Яровенко В.Л. Технологія спирту / В.Л. Яровенко, В.А. Маринченко, В.А. Смирнов. - М .: Колос, 1999. - 464 с.

15. Новий довідник хіміка і технолога. Сировина і продукти промисловості органічних і неорганічних речовин. Ч. ΙΙ. - СПб .: НПО «Професіонал», 2006. - 1142 с.

Масштабування процесу та реалізація на практиці біотехнологічного виробництва залежить від таких факторів, як наявність відтвореного масового дешевого сировини; простота трансформації сировини в живильне середовище; можливість апаратурного оформлення виробництва стандартним або новим ефективним обладнанням; високий вихід цільового продукту і забезпечення стандартності його якості. З огляду на перспективність використання БЦ в різних областях необхідне створення її промислового виробництва, при цьому важливим завданням є пошук відповідних джерел вуглецю, що мають низьку вартість і не конкурують з харчовою продукцією. Актуальним напрямом отримання БЦ є використання целюлозовмістні сировини для отримання з нього альтернативних поживних середовищ.

Масове використання викопних ресурсів протягом минулого століття і пов'язана з цим проблема забруднення викликали значне число екологічних та економічних проблем. Імовірно, ці ресурси будуть вичерпані в найближчому майбутньому. Дані причини сприяють прогресивному переходу до економіки на основі відновлюваних матеріалів (біомаси) в якості сировини для виробництва хімічних речовин, матеріалів, палива і енергії в межах так званої концепції биоконверсии. Целюлоза є одним з найбільш поширених полісахаридів і розглядається як невичерпне і універсальне джерело. Перспективним є використання так званих енергетичних, тобто швидкозростаючих рослин: міскантусу, проса, сорго і т.д. . Міскантус - рід багаторічних трав'янистих рослин сімейства мятлікові. Являє рослина висотою до 200 см, стебла прямостоячі, листя прості пластинчастої форми, верхівка гостра, підстава клиновидное, суцвіття у вигляді волоті. Рослина є багаторічним злаком і починаючи з третього року культивування може щорічно продукувати на одному полі протягом 15-20 років 10-15 т / га / рік сухої біомаси, що відповідає 4-6 т / га чистої целюлози.

У ІПХЕТ СО РАН розроблена технологія отримання ферментативних гідролізатів з міскантусу. Попередньо міскантус піддають хімічній обробці розведеними розчинами кислоти і / або лугу, а потім ферментативному гідролізу. Дослідження процесу біосинтезу БЦ на ферментативном гидролизате лігноцелюлозної матеріалу плодових оболонок вівса показало, що для успішного мікробіологічного синтезу ферментативний гідролізат повинен володіти біологічною доброкачественностью.

У даній роботі в якості субстрату для ферментативного гідролізу обраний лігноцелюлозних матеріал (ЛЦМ) міскантусу. ЛЦМ міскантусу отримують обробкою сировини в одну стадію розведеним розчином азотної кислоти при атмосферному тиску в стандартному обладнанні. Показано, що ферментативний гідролізат, отриманий з ЛЦМ міскантусу, є біологічно доброякісним для біосинтезу етанолу і не потребує додаткової технологічній обробці для звільнення його від шкідливих домішок.

Метою даної роботи було вивчення процесу біосинтезу БЦ на ферментативном гидролизате ЛЦМ міскантусу і дослідження структури отриманих зразків методом інфрачервоної спектроскопії. Слід зазначити, що дана задача неоднозначна, оскільки продуценти БЦ більш вимогливі до складу поживних середовищ, отже, дані по доброякісності середовища для дріжджів не можуть бути екстрапольовані на целлюлозосінтезірующіе мікроорганізми.

Матеріали і методи дослідження

ЛЦМ міскантусу був отриманий обробкою розведеним розчином азотної кислоти на дослідному виробництві ІПХЕТ СО РАН і мав наступний склад (%, в перерахунку на а.с.в.): масова частка кіслотонерастворімого лігніну - 10,6, масова частка золи - 4,8, масова частка целюлози по Кюршнеру - 86,7, масова частка пентозанів - 7,9.

Ферментативний гідроліз ЛЦМ міскантусу проводився в ферментере об'ємом 11 л у водному середовищі при 47 ± 2 ° С протягом 72 год за допомогою ферментних препаратів Целлолюкс-А (0,04 г / г субстрату) і Брюзайм BGX (0,1 мл / г субстрату ), активна кислотність підтримувалася на рівні 4,7 ± 0,2 за допомогою гідроксиду амонію і ортофосфорної кислоти, початкова концентрація субстрату склала 60 г / л, більш докладно методика описана в роботі.

Отриманий ферментативний гідролізат відфільтровує від залишків субстрату під вакуумом. Гідролізат представляв собою прозору рідину рудого кольору з кислим запахом, активна кислотність 4,7 од. рН. Загальна кількість редукуючих речовин (РВ) склало 49,0 г / л, з них ксилози - 2,8 г / л. У відфільтрований ферментативний гідролізат ЛЦМ з міскантусу вносився охолоджений настій чаю (1 л дистильованої води доводили до кипіння, додавали сухий чорний байховий чай, проводили екстракцію протягом 15 хв, охолоджували і фільтрували). При цьому живильне середовище стандартизованих за змістом РВ від 20 до 25 г / л і за змістом екстрактивних речовин чаю від 1,6 г / л до 4,8 г / л.

Як продуцента для біосинтезу БЦ використовувалася симбиотическая культура Мedusomyces gisevii Sa-12. Попередньо проводилася адаптація культури на досліджуваній живильному середовищі. Інокулят вносився в поживні середовища в кількості 10% від об'єму поживного середовища, культивування проводилося в статичних умовах при 27 ° С протягом 24 діб. Умови культивування обрані на підставі раніше проведених робіт.

Мікробіологічні показники (кількість дріжджів і оцтовокислих бактерій) контролювалися з використанням мікроскопа B-150 OPTIKA. Приріст плівки БЦ оцінювався гравіметричним методом (ваги лабораторні аналітичні Explorer EX-224), рівень активної кислотності контролювався за допомогою іономіра (іономер І-160 МІ). Концентрація РВ контролювалася спектрофотометричним методом (спектрофотометр «UNICO-2804», США) з використанням дінітросаліцілового реактиву, концентрація ксилози визначалася за стандартною методикою, яка заснована на утворенні фурфуролу з пентозанів.

Структура бактеріальної целюлози була досліджена на інфрачервоному спектрофотометрі «Інфралюм ФТ-801» в таблетках KBr.

Результати дослідження та їх обговорення

Зміна кількості дріжджів і оцтовокислих клітин в процесі культивування Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативном гидролизате ЛЦМ міскантусу представлено на рис. 1, зміна рівня активної кислотності в процесі культивування Мedusomyces gisevii Sa-12 - на рис. 2.

Концентрація клітин дріжджів в живильному середовищі в процесі культивування виявилася на порядок вище, ніж оцтовокислих бактерій. Для дріжджів лаг-фаза не спостерігалося, збільшення концентрації клітин відбувалося з 0 по 12 добу, після 12 діб відбувалася фаза відмирання. Для оцтовокислих бактерій спостерігалася лаг-фаза, до 8 діб їх кількість збільшувалася, з 8 по 10 добу кількість клітин залишалося постійним, після 10 діб відбувалася фаза відмирання.

Мал. 3. Залежність концентрації РВ і виходу БЦ від тривалості культивування

У процесі культивування симбіотичної культури Мedusomyces gisevii в живильному середовищі в результаті дії захисного механізму накопичуються проміжні продукти гліколізу: оцтова, глюконова кислоти, етанол і гліцерин, побічно про їх накопиченні можна судити по змінах рН. Початкова активна кислотність живильного середовища становила 4,0, до шостої доби культивування значення pH знизилося до 3,8. Далі в процесі культивування значення активної кислотності середовища підвищувався до 5,9. Підвищення активної кислотності не характерно для даного продуцента, проте схожа залежність описана при культивуванні продуцента Gluconacetobacter xylinus CH001 на кислотному гідролізаті міскантусу.

На рис. 3 представлена \u200b\u200bзалежність концентрації РВ і виходу БЦ від тривалості культивування.

Константа швидкості утилізації субстрату розрахована за формулою:

де Ку.с. - константа утилізації субстрату, сут-1; S1, S2 - концентрація РВ в початковий і кінцевий моменти часу; t1, t2 - початковий і кінцевий моменти часу, добу.

Мал. 4. Ік-спектр зразка БЦ

Утилізація субстрату відбувалася в два періоди: з 0 по 6 добу культивування константа швидкості утилізації субстрату склала 0,234 сут-1, з 6 по 24 значення знизилося в 12 разів і склало 0,020 сут-1. Швидка утилізація РВ з 0 по 6 добу пов'язано зі споживанням субстрату мікроорганізмами і їх активним розмноженням. З 6 по 24 добу РВ повільно витрачаються на підтримку життєдіяльності мікроорганізмів.

Гідролізат ЛЦМ міскантусу переважно складається з глюкози, концентрація ксилози в нульовий момент часу склала 1,2 г / л. На 7 добу культивування загальна концентрація РВ склала 4,9 г / л, при цьому кількість ксилози в гідролізаті практично не змінилося і склало 0,8 г / л. Через 24 діб культивування концентрація РВ в живильному середовищі склала 3,4 г / л, а ксилози - 0,3 г / л.

Швидкість синтезу продукту (бактеріальної целюлози) розрахована за формулою

де Кс.п. - константа синтезу продукту, сут-1; С1, С2 - маса продукту в початковий і кінцевий момент часу; t1, t2 - початковий і кінцевий моменти часу, добу.

У першу добу культивування на поверхні живильного середовища не спостерігалося чітко вираженої гель-плівки БЦ. На другу добу культивування утворилася тонка гель-плівка БЦ. Основний приріст біомаси відбувався з 2 по 6 добу культивування - вихід БЦ збільшився з 1,1% до 4,7%; константа швидкості синтезу продукту в цей період склала 0,363 сут-1. З 6 по 10 добу вихід БЦ виріс до 5,6%, константа швидкості синтезу продукту в цей період знизилася до 0,044 сут-1. Далі швидкість синтезу БЦ знижується, прагнучи до нульового значення.

З 10 по 24 добу вихід БЦ знизився до 1%, що вказує на що йдуть процеси деструкції, цей період збігається з фазою відмирання дріжджів і оцтовокислих бактерій. Таким чином, на практиці початок фази відмирання мікроорганізмів може служити критерієм закінчення процесу біосинтезу БЦ.

Ферментативний гідролізат ЛЦМ міскантусу не є сприятливим живильним середовищем для біосинтезу БЦ, найбільший вихід БЦ склав 5,6%, що в 1,6 разів менше, ніж вихід БЦ на синтетичній живильному середовищі при культивуванні Мedusomyces gisevii Sa-12 в аналогічних умовах - 9, 0%. Імовірно, це можна пояснити способом предобработки вихідної сировини і присутністю домішок в ферментативном гидролизате ЛЦМ міскантусу, які можуть пригнічувати біосинтез БЦ. Таким чином, доброякісність ферментативного гідролізату ЛЦМ міскантусу для біосинтезу етанолу не є гарантією доброякісності для біосинтезу БЦ, що обумовлено великою вимогливістю до якості поживних середовищ симбіотичних продуцентів Мedusomyces gisevii Sa-12 в порівнянні з Saccharomyces сerevisiae. Можна припустити, що для успішного біосинтезу БЦ слід використовувати більш чисті субстрати, наприклад технічну целюлозу міскантусу.

На рис. 4 представлений ІК-спектр зразка БЦ, синтезованого на ферментативном гидролизате ЛЦМ міскантусу.

В інфрачервоному спектрі зразка БЦ присутній інтенсивна смуга при 3381 см-1, яка вказує на валентні коливання OH-груп. Менш інтенсивна смуга при 2917 см-1 зумовлена \u200b\u200bвалентними коливаннями груп CH2, CH. В спектрі БЦ смуги в діапазоні 2000-1500 см-1 належать деформаційних коливань OH-груп міцно зв'язаної води. Слабкі смуги поглинання в діапазоні: 1430-1370 см-1 обумовлені деформаційних коливань груп CH2; 1360-1320 см-1 - деформаційні коливання груп OH в CH2OH. Смуги при тисяча двісті вісімдесят одна і 1235 см-1 вказують на деформаційні коливання OH-груп в спиртах. Смуга при 1204 см-1 вказує на деформаційні коливання OH-груп. Смуги поглинання в області 1000-1200 см-1 обумовлені в основному валентними коливаннями C-O-C і C-O в спиртах. Таким чином, методом ІК підтверджено, що БЦ, отримана на ферментативном гидролизате ЛЦМ, є чистим з'єднанням, що містить тільки целюлозу.

Досліджено процес біосинтезу БЦ симбиотической культурою Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативном гидролизате ЛЦМ міскантусу. Основна утилізація субстрату відбувається за 6 діб культивування, константа утилізації субстрату становить 0,236 сут-1. Встановлено, що чисельність оцтовокислих бактерій в процесі культивування на порядок менше, ніж дріжджів, і через 10 діб становить 1,1 КУО / мл. Показано, що на практиці початок фази відмирання симбіотичних мікроорганізмів може служити критерієм закінчення процесу біосинтезу, так як ця фаза збігається з процесом деструкції БЦ. Показано, що ферментативний гідролізат ЛЦМ міскантусу не є доброякісною живильним середовищем для біосинтезу БЦ: вихід БЦ на 10 добу культивування становить 5,6%, що в 1,6 разів менше, ніж вихід БЦ на синтетичній живильному середовищі, а на 24 добу вихід падає до 1,0%, тобто БЦ піддається деструкції. За допомогою інфрачервоної спектроскопії встановлено, що БЦ є чистим з'єднанням, що містить тільки целюлозу.

Дослідження виконано за рахунок гранту Російського наукового фонду (проект № 17-19-01054).

бібліографічна посилання

Гладишева Є.К. БІОСИНТЕЗ БАКТЕРІАЛЬНОЇ ЦЕЛЮЛОЗИ НА ферментативного гідролізату лігноцелюлозних МАТЕРІАЛУ міскантус // Фундаментальні дослідження. - 2017. - № 9-2. - С. 290-294;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id\u003d41742 (дата звернення: 13.12.2019). Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»