Biosinteza celuloze. Sinteza saharoze in polisaharidov Besedilo znanstvenega dela na temo "Biosinteza bakterijske celuloze s kulturo Medusomyces gisevii"

Celična stena nastane kot rezultat razvoja srednje lamele. Takoj po popolni delitvi jedra rastlinske celice v telofazi mitoze nastane čez delilno celico fragmoplast.Sestavljen je iz številnih sploščenih membranskih veziklov - fragmos,vsebujejo sestavine celične stene. Pri njihovi gradnji sodeluje citoskelet. Vsi polisaharidi celične stene, razen celuloze, se sintetizirajo v aparatu Gold-ji. Pakirani so v vezikle, ki se prepeljejo do gojišča

srednja plošča in se z njo združita. Mediana ploščice se poveča proti plazmolemi in se z njo združi ter deli dve hčerinski celici. Končno se novonastala celična stena poveže z že obstoječo primarno celično steno.

Skoraj vse "necelulozne" komponente celične stene - polisaharidi, strukturni proteini, širok spekter encimov - nastanejo v Golgijevem aparatu in so v njegovih mehurčkih usklajeno usmerjene v celično steno.

Do zdaj še niso odkrili genov, ki bi kodirali polisaharidne sintaze, vključene v sintezo hrbtenice "neceluloznih" polimerov. Ugotovljeni so bili geni več fukozilnih in galaktoziltransferaz, ki na glavno verigo vežejo posamezne sladkorje.

Edina polimera, ki se sintetizirata z zunanje strani plazemske membrane, sta celuloza in kaloza. Ustreznost tega postane očitna, če upoštevamo veliko dolžino tvorjenih celuloznih mikrofibril in potrebo po njihovem filigranskem pakiranju v celično steno. Kaloza se od celuloze razlikuje po prisotnosti verig β 1 → 3-D-glukana, ki lahko tvorijo spiralne duplekse in triplekse. Kaloza se tvori v več vrstah celic na določenih stopnjah tvorbe celične stene, na primer v kalijoči cvetni pelod ali v srednji lamini delilnih celic. Kalozo se lahko sintetizira tudi med stresnimi reakcijami ali kot odziv na glivično okužbo.

Sintezo celuloze katalizirajo multimerni encimski kompleksi, ki se nahajajo na koncih podolgovatih celuloznih mikrofibrilov. Ti terminalni kompleksi so jasno vidni pod elektronskim mikroskopom.

Slika: 1.30. Shema zgradbe in dela celulozne sintaze

Pri nekaterih morskih algah so končni kompleksi sinteze celuloze linearni; v vseh kritosemenkah tvorijo rozetne strukture. Terminalni kompleksi se pojavijo v membrani plazmaleme v trenutku aktivacije sinteze celuloze.

Začetni substrat za celulozno sintazo je UDP-glukoza. Tvori ga encim saharoza sintaza neposredno iz saharoze. Številne izoforme tega encima najdemo v plazemski membrani. Povezani so s celulozno sintazo in lahko dovajajo UDP-glukozo neposredno v njen katalitični center (slika 1.30).

Relativno nedavno je bilo ugotovljenih več rastlinskih genov, ki kodirajo encime za sintezo celuloze, zlasti gene CesA, ki se intenzivno izražajo v bombažnih vlaknih med aktivno sintezo celuloze sekundarne celične stene. Polipeptidi, ki jih kodirajo ti geni, imajo osem transmembranskih domen in maso približno 110 kDa. Odkritje genov CesA je omogočilo identifikacijo številnih drugih genov, ki kodirajo sinteze polisaharidov celične stene.

V rastlinah v procesu fotosinteze ne nastajajo samo fosforni estri sladkorjev ali enostavni sladkorji, temveč tudi bolj zapletene oblike ogljikovih hidratov - saharoza, škrob, vlaknine. Tudi razgradnja zapletenih oblik ogljikovih hidratov na enostavne poteka zelo hitro. To opazimo na primer med kalitvijo semen, staranjem vegetativnih organov itd. Preprosti sladkorji ali njihovi fosforjevi estri, ki nastanejo med razgradnjo, se pretakajo v reproduktivne organe, kjer se iz njih spet sintetizirajo kompleksni ogljikovi hidrati. In končno, v rastlinah postopki medsebojnih transformacij ogljikovih hidratov potekajo zelo enostavno.

Medsebojna pretvorba monosaharidov poteka skozi fosforne estre sladkorjev ali njihove derivate uridin difosfata (derivati \u200b\u200bUDP). UDP-derivati \u200b\u200bsladkorja so takšen ali drugačen sladkor, ki je prek dveh ostankov fosforne kisline kombiniran z uridinom, na primer:

Slika 1. Uridin difosfat glukoza

Sinteza saharoze

Saharoza je najpomembnejši ligosaharid, proizveden v rastlinah, v obliki katerega se vezani ogljik in energija prenašata skozi rastlino. Sestavljen je iz ostanka α-D-glukoze v svoji piranozni obliki, ki je z glikozidno vezjo povezana z β-D-fruktozo v obliki furanoze. Ker anomerni ogljikov atom obeh monosaharidov sodeluje pri tvorbi glikozidne vezi, sta njihovi hemiacetalni skupini blokirani in noben od obročev se ne more odpreti. Tako je saharoza sladkor, ki se ne reducira (ne zmanjša Fehlingovega in Benediktovega reagenta) in je, razen izjemne občutljivosti na kislo hidrolizo, kemično inerten. Pri segrevanju s kislinami ali pod delovanjem saharaze (invertaze) se saharoza hidrolizira in tvori invertni sladkor - mešanico glukoze in fruktoze. Saharoza je zelo topna v vodi in ima sladek okus.

Saharoza se uporablja kot živilski proizvod, pa tudi pri proizvodnji površinsko aktivnih snovi (saharozni estri z višjimi kislinami). Glavni vir proizvodnje saharoze je sladkorna pesa, ki vsebuje do 23% saharoze, in sladkorni trs, katerega stebla vsebujejo 10-18% saharoze. Zdaj je bilo ugotovljeno, da se saharoza ne sintetizira samo v kloroplastih, temveč tudi v citoplazmi fotosintetizirajočih celic iz UDP-glukoze in fruktoze-6-fosfata, ki izvirajo iz
dihidroksiaceton fosfat. Ta snov nastane med fotosintezo v kloroplastih in nato vstopi v citoplazmo. V nefotosintetičnih tkivih (na primer v endospermu kalivih ricinusovih zrn) nastane tudi saharoza iz UDP-glukoze in fruktoza-6-fosfata v citoplazmi celic.

Saharoza (trs, sladkorni pes) je v naravi najbolj razširjen disaharid. V rastlinah nastane iz glukoze in fruktoze. Prva stopnja je fosforilacija glukoze:

Glukoza + ATP → glukoza-6-fosfat + ADP,

nato se glukoza-6-fosfat izolira v glukoza-1-fosfat. Glukoza-1-fosfat se kombinira z UTP, kar povzroči cepitev pirofosfatne kisline in nastanek spojine glukoze z uridin difosforno kislino (UDP) - uridin difosfat glukoze.

Hkrati pride do fosforilacije fruktoze pod delovanjem encima fruktokinaze s sodelovanjem ATP:

fruktoza + ATP → fruktoza-6-fosfat + ADP.

Po tem UDP-glukoza sodeluje s fruktozo-6-fosfatom, pri čemer sodeluje encim saharoza-fosfat-UDP-glukoziltransferaza. Na koncu nastali saharoza-6-fosfat hidrolizira encim fosfataza, da nastane prosta saharoza. Tako so za biosintezo ene molekule saharoze potrebne 3 visokoenergijske fosfatne vezi, ta reakcija je nepopravljiva. V nefotosintetičnih tkivih nekaterih rastlin, na primer v koreninah sladkorne pese, gomoljih krompirja in drugih, lahko saharoza nastane iz proste fruktoze:

UDP-glukoza + fruktoza ↔ saharoza + UDP.

Reakcijo katalizira encim saharoza-UDP-glukoziltransferaza in je lahko odvisna od pogojev usmerjena tako v sintezo kot v razgradnjo saharoze.

Sinteza škroba

Škrob je rezervni polisaharid rastlin in ga je mogoče dolgo hraniti v rastlini ali pa ga porabiti dovolj hitro. Dolgo časa je shranjen v številnih semenih, gomoljih in korenike in se uporablja šele, ko ti organi kalijo. Škrob v času hitre fotosinteze v kloroplastih nastane kratek čas, v naslednjem temnem obdobju pa se porabi in izteče iz listov v obliki saharoze. Škrob se vedno tvori in shranjuje v obliki škrobnih zrn, ki jih najdemo v plastidah - kloroplastih ali amiloplastih. Škrobna zrna so visoko organizirane strukture, katerih oblika in velikost sta zelo raznoliki, a pogosto značilni za določeno rastlinsko vrsto. Oblika zrn je lahko sferična, jajčasta, lečasta ali nepravilna; velikost se lahko giblje od 1 do 100 mikronov. Največ škrobnih zrn najdemo v krompirju, najmanjše pa v rižu in ajdi. Škrobna zrna vsebujejo do 20% vode (od tega je 10% kemično vezanih na škrob) in številne koncentrične plasti škroba. Škrobna zrna nastanejo z nanosom novonastalih plasti na že obstoječe.

Vsebnost mineralov v škrobu je zelo nizka - 0,2–0,7%, predstavlja jih predvsem fosforjeva kislina. Nekatere visoko molekularne maščobne kisline (palmitinska, stearinska itd.) Najdemo v škrobu, katerega vsebnost doseže 0,6%. Škrob je mešanica dveh polisaharidov - amiloze in amilopektina. Molekule amiloze so dolge, nerazvejane verige, ki vsebujejo od 100 do nekaj tisoč ostankov glukopiranoze, povezane z glikozidnimi vezmi. Študije difrakcije rentgenskih žarkov so pokazale, da imajo molekule amiloze vijačno strukturo s premerom 1,3 nm s šestimi zaporednimi ostanki glukoze na spiralni obrat.

Molekule amiloze so topne v vroči vodi, vendar je nastala raztopina nestabilna in nato pride do spontanega obarjanja amiloze, znanega kot retrogradnost. To je posledica težnje dolgih in tankih molekul amiloze, da se poravnajo ena ob drugo in prek vodikovih vezi tvorijo netopne agregate. Uridin difosfat glukoza (UDPC) lahko služi kot darovalec ostankov glukoze v biosintezi amiloze. Za njegovo tvorbo v reakcijskem mediju je potrebna prisotnost semena, ki je lahko polisaharidi, zgrajeni iz samo 3-4 ostankov glukoze, povezanih z α (1-4) vezmi.

Preostala glukoza se prenese v akceptor (primer), kjer pride do raztezanja verige. Reakcija poteka po shemi:

UDPG + akceptor (G) k - UDPG + akceptor (G) k + 1,

kjer Г - ostanki glukoze.

Encim, ki katalizira to reakcijo, se imenuje UDPG škrobna glukoziltransferaza.

V večini rastlin aktivni darovalec glukoze ni UDP-glukoza, ampak adenozin difosfat glukoza (ADPG). Reakcija vezave ostankov glukoze iz ADPG na akumulator z nizko molekulsko maso poteka na podoben način in jo katalizira encim ADPG-škrob-glukoziltransferaza. S sintezo razvejane molekule amilopektina, ki ima α (1-6) -veze, se pojavi z uporabo encima α-glukantransferaze (Q-encim). V sintezo škroba sodeluje tudi D-encim ali glukoziltransferaza, ki tvori α (1-4) -povezave in sodeluje pri tvorbi semena.

Razgradnja škroba poteka s sodelovanjem dveh procesov - hidrolize in fosforolize.Hidrolitska razgradnja škroba poteka pod delovanjem štirih encimov iz razreda hidrolize α-amilaze, katalizira cepitev α (1-4) -vezi in vezi se naključno pretrgajo. Končni produkt te razgradnje so maltoza, glukoza, dekstrini. Pod delovanjem β-amilaze se α (1-4) -povezave cepijo z nastankom ostankov maltoze. Encim glukoamilaza katalizira zaporedno cepljenje ostankov glukoze iz molekule škroba. Amilopektin-1,6-glukozidaza ali R-encim katalizira cepitev α (1-6) -vez v molekuli amilopektina, torej deluje na vejne točke.

Fosforoliza je dodajanje fosforne kisline na mestu cepitve glukozidne vezi med ostanki monosaharidov v polisaharidni verigi s tvorbo glukoze-1-fosfata. To reakcijo katalizira encim glukon fosforilaza, ki spada v razred transferaz. Škrob v rastlini se lahko zelo hitro razgradi, saj se razgradni encimi nahajajo v vseh organih rastline.

Sinteza celuloze

Celuloza je v vodi netopna, v njej le nabrekne. S kislo hidrolizo (vre v žveplovi kislini) se spremeni v glukozo, s šibkejšo hidrolizo - v celobiozo. Z uporabo rentgenske difrakcijske analize je bilo ugotovljeno, da ima molekula celuloze nitaste oblike. Te nitaste molekule so zaradi vodikovih vezi povezane v snope po 40-60 kosov na micelo. V celičnih stenah rastlin so celulozne micele povezane z vodikovimi vezmi z različnimi heteropolisaharidi. Na primer, v belem javorju so to ksiloglukan, arabinogalaktan in ramnogalakturon, ki so med seboj povezani z glikozidnimi vezmi. Poleg tega obstajajo dokazi, da je v gradnjo rastlinske celične stene vključen poseben, hidroksiprolin bogat glikoprotein ekstenzin.

Celuloza je zgrajena iz ostankov β-glukoze. Pri biosintezi celuloze ne sodeluje prosta glukoza, temveč njen HDF derivat - gvanozin difosfat glukoza s sodelovanjem encima celulozne sintetaze po shemi:

HDF - glukoza + (glukoza) do → HDF + (glukoza) do + 1

Razgradnja celuloze poteka predvsem po hidrolitični poti pod delovanjem encima celulaze do celiobioznega disaharida.

Ogljikovi hidrati se prevažajo v obliki saharoze. V procesu fotosinteze nastaja veliko ogljikovih hidratov in v zvezi s tem je velik pomen odtok asimilatov v druge dele celice iz kloroplastov. Prodiranje fosforiliranih heksoz in saharoze skozi kloroplastno membrano je težko; triozni fosfati (PHA in PDA) najlažje prodrejo skozi kloroplastne membrane. Predpostavlja se, da nastali kompleksni ogljikovi hidrati razpadejo na triozne fosfate in se v tej obliki premaknejo v citoplazmo, kjer lahko služijo kot material za resintezo heksoz, saharoze in škroba.

Medcelični parenhimski transport se izvaja na dva načina - vzdolž plazmodesmata (symplast) ali skozi prosti prostor (apoplast). Saharoza, ki nastane v celicah listnega mezofila, se desorbira v apoplast. Če zapustimo parenhimske celice v apoplast, se saharoza z invertazo cepi v heksoze. Heksoze se premikajo vzdolž apoplasta do prenosnih celic prevodnih žarkov vzdolž koncentracijskega gradienta. Ob stiku s prenosnimi celicami floema se pretvorijo nazaj v saharozo. Nato se sita naložijo, saharoza teče proti koncentracijskemu gradientu in zahteva porabo energije (ATP).

Predpostavlja se, da saharoza prečka membrano s pomočjo nosilca v kompleksu s protonom. Hkrati se zaradi dela H + -ATP-aze ioni H + izčrpajo iz floemskih celic, nato pa se vrnejo po gradientu pH in vlečejo saharozo skupaj z gradientom njene koncentracije. Glavna transportna oblika ogljikovih hidratov v floemu je saharoza (C 12 H 22 O 11). Pri nekaterih vrstah so kot saharoza oligosaharidi (rafinoza, stahioza) in nekateri alkoholi transportna oblika ogljikovih hidratov.



V ciklu Calvin-Benson nastane fruktoza-6-fosfat (F-6-P), kot je navedeno zgoraj. Ta heksoza fosfat lahko določeni encimi pretvorijo v druge fosforilirane heksoze, in sicer v glukozo-6-fosfat (G-6-P) in glukozo-1-fosfat (G-1-P). Tudi obratna transformacija se zgodi zlahka.

Iz teh treh heksoznih fosfatov se nato zgradijo verige molekul ogljikovih hidratov, ki se uporabljajo za reakcije transporta, skladiščenja in sinteze. Da lahko pride do takšnih transformacij, je treba najprej aktivirati heksoze fosfate. To se običajno doseže kot rezultat njihove vezave na nukleotide - zapletene krožne strukture, podobne ATP adenilne kisline. Produkt te adicijske reakcije so nukleotidni derivati \u200b\u200bmonosaharidov ali nukleotidni sladkorji. Najpogostejša uridin difosfoglukoza (UDPG) nastane z reakcijo med uridin trifosfatom (UTP) in glukoznim 1-fosfatom (G-1-P). UTP sam nastane posredno kot rezultat prenosa fosfatne skupine iz ATP v UDP (uridin difosfat).

Nukleotidi ATP in UTP so prisotni v vseh celicah, ker se uporabljajo skupaj z drugimi nukleotidi v sintezi DNA in RNA.

Sladkor se skozi rastlino prevaža v obliki saharoze, disaharida, ki je sestavljen iz ostankov glukoze in fruktoze (slika 5.2). Saharoza nastane z reakcijo med UDPG in F-6-P:

Ravnotežje te reakcije se močno premakne v smeri sinteze saharoze, ki zagotavlja možnost kopičenja tega disaharida v pomembnih koncentracijah. Za nadaljnjo uporabo se mora saharoza najprej cepiti: encim invertaza katalizira svojo hidrolizo s tvorbo proste glukoze in fruktoze.

Energija glikozidne vezi se v takšni reakciji izgubi in porazdeli med dve molekuli. Če se torej glukoza in fruktoza med dihanjem razpadata ali sodelujeta (kot surovina) pri sintezi polisaharidov, potem morata najprej zaradi ATP spet opraviti fosforilacijo. Procesi sinteze in razgradnje saharoze jasno kažejo, da pogosto anabolične in katabolične reakcije (reakcije sinteze in razgradnje) potekajo po različnih poteh.

Sinteza škroba in celuloze

Dolge polimerne verige škroba in celuloze so zgrajene iz istih osnovnih enot - ostankov glukoze, ki so le povezani na različne načine. Ta strukturna razlika je odgovorna za dejstvo, da se obravnavana polimera glukoze (glukana) po naravi bistveno razlikujeta; škrob se na primer zlahka prebavi v človeškem telesu "in celuloza se sploh ne prebavi. Njihova glavna razlika je v tem, da sta 1. in 4. atom ogljika dveh sosednjih ostankov glukoze povezana z α-vezema v škrobu in v celulozi (β -sveza (slika 5.3). Škrob je predstavljen v dveh oblikah: linearni polimer ali amiloza, ki ne vsebuje nobenih drugih vezi, razen α-1,4-glikozidnih, in razvejan polimer ali amilopektin, v katerem je skupaj z α-1,4 -glikozidne vezi obstajajo tudi 1,6-vezi. Razlika v naravi vezi določa tudi neenako prostorsko razporeditev polimernih verig. Škrob je glavni rezervni polisaharid rastline. Je netopen v vodi in se plast za plastjo nalaga v škrobnih zrnih, ki jih vsebujejo kloroplasti (glej sl. 2.20) ali v levkoplastih brez klorofila v skladiščnih tkivih stebla, korenin in semen. Včasih so celice shranjevalnega tkiva dobesedno zamašene s škrobnimi zrni, ki jih je v njih enostavno prepoznati, saj so sposobna obarvati modri z jodom. Ker je škrob v vodi netopen, za razliko od saharoze in heksoz v celicah ne povzroča osmotskega učinka (glej poglavje 6). Zato nastajanje škroba v listnih celicah v obdobjih intenzivne fotosinteze preprečuje njegovo supresijo, ki nastane kot posledica kopičenja fotosintetskih produktov. V temi se škrob postopoma spet hidrolizira, da nastane glukozni fosfat, ki se nato pretvori v saharozo, ki se prepelje v druge dele rastline.

Slika: 5.3. Struktura škroba (A) in celuloze (B) (Spremenil J. Bonner, AW Galston. 1952. Principles of Physiology Plant, San Francisco, WH Freeman and Co.) Upoštevajte, da sta kemični formuli škroba in celuloze enaki, vendar se razlikujeta ti polisaharidi glede na prostorsko usmerjenost njihovih kisikovih mostov. A. Škrob, glavni polisaharid rastline, je zgrajen iz dveh ločenih komponent: amiloze z dolgimi nerazvejanimi enotami glukoze in amilopektina, ki je sestavljen iz velikega števila kratkih razvejanih verig. B. Celuloza, glavna sestavina primarne celične stene, obstaja v obliki dolgih polimernih verig. Verige se kombinirajo v micelarne pramene, slednje pa v mikrofibrile. Mikrofibrile, ki so dovolj velike za ogled z elektronskim mikroskopom, predstavljajo "osnovo" in "votek" celične stene

Začetni produkt za sintezo škroba je adenozin difosfoglukoza (ADPG), ki nastane iz ATP in G-1-P:

Molekula škroba nastane s postopnim dodajanjem enega ostanka glukoze za drugim v reakciji ADPG s predhodno oblikovano glukozno verigo:

Z nizko vsebnostjo saharoze se škrob razgradi in. pretvori v saharozo. Vendar se sprva razdeli na ostanke glukoze in vsakemu doda ostanek fosforne kisline, tj. Tvori se G-1-P, ki zagotavlja ohranitev vezavne energije:

Ta G-1-P lahko nato uporabimo za sintezo saharoze, ki smo jo opisali zgoraj. V semenih in nekaterih drugih organih, v katerih se hkrati razgradijo velike količine škroba, se pod delovanjem a-amilaze razgradi na maltozni disaharid (G-G). Nato se maltoza razgradi na glukozo, iz katere se ponovno sintetizira saharoza (za transport). Pri tej drugi poti se v nasprotju s prvo vezna energija ne ohrani, zato je tu ATP potreben za pretvorbo glukoze v glukozo-6-P.

Celuloza, najpogostejši ogljikov hidrat na zemlji, je glavna sestavina primarne celične stene. Njegove molekule so zgrajene na enak način kot molekule škroba, s to razliko pa, da vlogo darovalca glukoze igra drugi nukleotidni derivat monosaharida - gvanozin-difosfoglukoza (GDPG) - in da vez med monomernimi enotami ne pripada α-, temveč tipa β.

V nekaterih primerih je UDPG lahko tudi darovalec glukoze za sintezo celuloze.

V telesu višjih rastlin se celuloza redko razgradi (razen razgradnje, ki jo povzroči aktivnost mikrobov). Dve dobro znani izjemi od tega pravila se nanašata na celice v območju ločevanja listov, ki so nastale pred osipanjem listov, in ksilemske posode, v katerih se prečne stene raztopijo. V ločevalnem območju lista encim celulaze uniči celične stene in celulozo, ki je v njih, razdeli na posamezne monomerne enote, to je do glukoze. Celične stene, oslabljene s tem postopkom, sčasoma počijo in list odpade.

Celulozne mikrofibrile v celični steni drži skupaj matrika mešanih polisaharidnih verig, predvsem ksiloglukanov in arabinogalaktanov (glej sliko 2.31). (Ksiloza in arabinoza sta sladkorja s petimi ogljiki (pentoze), galaktoza pa je heksoza, podobna glukozi.) Ti polisaharidi se sintetizirajo tudi iz predhodnih sestavin, nukleotidnih sladkorjev, predvsem v diktosomih. Mehurčki, ki se ločijo od diktiozomov, se na koncu združijo s plazmolemo in na ta način prenesejo svojo vsebino v tvorno celično steno.

Vsi polisaharidi torej zlahka prehajajo drug v drugega, vendar njihova sinteza vedno gre skozi fazo nukleotidnih sladkorjev, medtem ko razpad poteka bolj neposredno.

Večina rastlinske hrane vsebuje tako imenovane vlaknine in pektin, ki so v prebavilih neprebavljivi. So pa nujni za človeka. Če je hrana zanje slaba, pride do črevesne atonije in zaprtja. Tako so vlaknine regulator črevesne motorične funkcije.

Vlaknine izboljšajo delovanje črevesja, upočasnijo gnitje in tvorbo plinov ter zmanjšajo absorpcijo nekaterih škodljivih snovi. Tako je na primer za preprečevanje poklicnih bolezni pri delavcih s kovinskimi solmi in radioaktivnimi snovmi priporočljivo jesti rdeči ribez, ki vsebuje veliko pektinov.

Polisaharid: vlakna

Vlakna (celuloza) - polisaharid, ki predstavlja glavnino rastlinskih celičnih sten. Vlakna v vodi niso topna, v njih le nabreknejo. Vlaknine predstavljajo več kot 50% lesa. V bombažnih vlaknih je več kot 90%. Ko se vlakna prekuhajo z močno žveplovo kislino, se popolnoma pretvorijo v glukozo. S šibkejšo hidrolizo dobimo celobiozo iz vlaknin.

V molekuli vlaken so ostanki celobioze povezani z glikozidnimi vezmi v obliki dolge verige. Molekulska masa vlaken ni natančno določena. Menijo, da vlaknine niso posamezna snov, temveč mešanica homolognih snovi. Molekulske mase celuloze, pridobljene iz različnih virov, precej nihajo: bombaž - 330.000 (v verigi glikozidnih ostankov leta 2020); ramija - 430.000 (2660 ostankov), smrekov les - 220.000 (1360 ostankov). S pomočjo rentgenske difrakcijske analize je bilo ugotovljeno, da imajo molekule vlaken navojno obliko. Te nitaste molekule se kombinirajo v snope - micele. Vsaka micela vsebuje približno 40-60 molekul vlaken.

Kombinacija posameznih molekul vlaken v micele nastane zaradi vodikovih vezi, ki se izvajajo tako zaradi vodikovih atomov hidroksilnih skupin vlakna kot zaradi molekul vode, ki jih vlakno adsorbira. V celičnih stenah rastlinskih celičnih micel so z vodikom vezane na različne heteropolisaharide. Na primer, v belem javorju so ksiloglukan, ki je medsebojno povezan z glikozidnimi vezmi, sestavljenimi iz ostankov glukoze, ksiloze, galaktoze in fukoze; arabinogalaktan, zgrajen iz ostankov arabinoze in galaktoze; ramnogalakturonan, ki ga tvorijo ostanki galakturonske kisline in ramnoze. Poleg tega obstajajo dokazi, da je v gradnjo rastlinske celične stene vključen tudi poseben, s hidroksiprolinom bogat glikoprotein ekstenzin, zlasti v zgodnjih fazah njegovega nastanka. Pri lignifikaciji celičnih sten se v njih kopiči tudi lignin.

Vlaknine se ne prebavijo v človeškem prebavnem traktu. Prebavijo ga le prežvekovalci, v želodcu katerih so posebne bakterije, ki vlakno hidrolizirajo s pomočjo encima celulaze, ki ga izločajo.

Hemiceluloza (polceluloza). Pod tem imenom je združena velika skupina polisaharidov z visoko molekulsko maso, ki se ne raztopijo v vodi, so pa topni v alkalnih raztopinah. Hemiceluloze najdemo v pomembnih količinah v lignificiranih delih rastlin: slama, semena, oreški, les, koruzni storži. V otrobih najdemo veliko količino hemiceluloze. Hemiceluloze kisline lažje hidrolizirajo kot vlaknine. Hkrati tvorijo manozo, galaktozo, arabinozo ali ksilozo in so zato poimenovani - manani, galaktani in pentozani (araban ali ksilan).

1

Preučevan je bil postopek biosinteze bakterijske celuloze (BC) na encimskem hidrolizatu lignocelulozne snovi miskantusa. Lignocelulozni material smo dobili z obdelavo miskantusa z razredčeno raztopino dušikove kisline v pilotni napravi. Encimsko hidrolizo smo izvedli v 11 l fermentorju. Biosinteza BC je bila izvedena z uporabo simbiotske kulture Medusomyces gisevii Sa-12. Ugotovljeno je bilo, da je število ocetnokislinskih bakterij med gojenjem 1,2-krat manj kot kvasovk. Glavni izkoristek substrata se pojavi v 6 dneh gojenja, konstanta izkoriščenosti substrata je 0,234 dan-1. Pokazalo se je, da encimski hidrolizat lignoceluloznega materiala miskantusa ni benigni hranilni medij za biosintezo BC, donos BC je bil 5,6%, kar je 1,6-krat manj kot pridelek na sintetičnem hranilnem mediju. Ugotovljeno je bilo, da je bakterijska celuloza, pridobljena na tem mediju, kemično čista.

bakterijska celuloza

Medusomyces gisevii

infrardeča spektroskopija

encimski hidrolizat

miskantus

1. Bakterijska celuloza, ki jo sintetizira Gluconacetobacter hansenii za uporabo v medicini / T.I. Gromovs in [drugi] // Uporabna biokemija in mikrobiologija. - 2017. - T. 53, št. 1. - str. 69–75.

2. Obeti za uporabo bakterijske celuloze v mesnih izdelkih / T.I. Thunder in [drugi] // Mesna industrija. - 2013. - št. 4. - str. 32–35.

3. Octave S. Biorafinery: v smeri industrijske presnove / S. Octave, D. Thomas // Biochimie. - 2009. - št. 91. - str. 659–664.

4. Gismatulina Y.A., Budaeva V.V., Sakovich G.V., Veprev S.G., Shumny V.K. Celuloza iz različnih delov soranovskii miscanthus // Russian Journal of Genetics: Applied Research. - 2015. - Letn. 5, številka 1. - str. 60–68.

5. Gismatulina Yu.A. Primerjava fizikalno-kemijskih lastnosti celuloz, dobljenih s kombinirano metodo iz lista in stebla miskantusa / Yu.A. Gismatulina / Bilten altajske znanosti. - 2014. - št. 1 (19). - S. 302–307.

6. Makarova E.I. Biokonverzija neživilskih surovin, ki vsebujejo celulozo: energetske rastline in kmetijski odpadki: dis. ... Kandidat tehnični znanosti. - Shchelkovo, 2015. - 161 str.

7. Gladysheva E.K. Značilnosti strukturnih značilnosti bakterijske celuloze, sintetizirane na encimskem hidrolizatu lignocelulozne snovi iz ovsenih plodov lupine / E.K. Gladysheva, E.A. Skiba, L.A. Aleshina // Polzunovsky Bulletin. - 2016. - št. 4–1. - S. 152-156.

8. Skiba E.A., Budaeva V.V., Baibakova O.V., Udoratina E.V., Shakhmatov E.G., Shcherbakova T.P., Kuchin A.V., Sakovich G.V. Encimska hidroliza lignoceluloznih materialov v vodnih medijih in naknadna mikrobiološka sinteza bioetanola // Kataliza v industriji. - 2016. - Letn. 8, številka 2. - str. 168–175.

9. Skiba E.A. Metoda za določanje biološke dobre kakovosti hidrolizatov iz celuloznih surovin s pomočjo seva Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-1693 / E.A. Skiba // Izvestiya vuzov. Uporabna kemija in biotehnologija. - 2016. - št. 1 (16). - S. 34–44.

10. Gladysheva E.K. Biosinteza bakterijske celuloze s kulturo Medusomyces gisevii / E.K. Gladysheva, E.A. Skiba // Bilten Voroneške državne univerze za inženirske tehnologije. - 2015. - št. 3. - str. 149-156.

11. Gladysheva E.K. Preiskava vpliva temperature na sintezo bakterijske celuloze s strani proizvajalca Medusomyces gisevii / E.K. Gladysheva // Sodobne visoke tehnologije. - 2016. - št. 8–1. - S. 36-40.

12. Yurkevič D.I. Medusomicete (Kombucha): znanstvena zgodovina, sestava, značilnosti fiziologije in metabolizma / D.I. Yurkevič, V.P. Kutyshenko // Biophysics. - 2002. - št. 6. - str. 1116–1129.

13. Yang, X.-Y., Huang C., Guo H.-J., Xiong L., Li Y.-Y., Zhang H.-R., Chen X.-D. Biokonverzija hidrolizatov slonske trave (Pennisetum purpureum) v bakterijsko celulozo z Gluconacetobacter xylinus // Journal of Applied Microbiology. - 2013. - št. 115. - str. 995-1002.

14. Yarovenko V.L. Alkoholna tehnologija / V.L. Yarovenko, V.A. Marinchenko, V.A. Smirnov. - M.: Kolos, 1999. - 464 str.

15. Nov priročnik za kemika in tehnologa. Surovine in proizvodi iz industrije organskih in anorganskih snovi. Ch. ΙΙ. - SPb.: NPO Professional, 2006. - 1142 str.

Povečanje postopka in izvajanje biotehnološke proizvodnje v praksi je odvisno od dejavnikov, kot so razpoložljivost ponovljive mase poceni surovin; enostavnost pretvorbe surovin v hranilni medij; možnost strojne zasnove proizvodnje s standardno ali novo učinkovito opremo; visok donos ciljnega izdelka in zagotavljanje standarda njegove kakovosti. Glede na možnosti uporabe BC na različnih področjih je treba ustvariti njegovo industrijsko proizvodnjo, medtem ko je pomembna naloga najti primerne vire ogljika, ki imajo nizke stroške in ne konkurirajo živilskim izdelkom. Dejanska smer pridobivanja BC je uporaba surovin, ki vsebujejo celulozo, da se iz njih pridobijo alternativni hranilni mediji.

Množična uporaba fosilnih virov v preteklem stoletju in s tem povezan problem onesnaževanja sta povzročila veliko število okoljskih in gospodarskih težav. Verjetno se bodo ti viri v bližnji prihodnosti izčrpali. Ti razlogi prispevajo k postopnemu prehodu na gospodarstvo, ki temelji na obnovljivih materialih (biomasi) kot surovinah za proizvodnjo kemikalij, materialov, goriv in energije v okviru tako imenovanega koncepta biokonverzije. Celuloza je eden najpogostejših polisaharidov in velja za neizčrpen in vsestranski vir. Obeta se uporaba tako imenovane energije, tj. hitro rastoče rastline: miskantus, proso, sirek itd. ... Miscanthus je rod večletnih zelnatih rastlin iz družine bluegrass. Je rastlina do 200 cm visoka, pokončna stebla, preprosti lističasti listi, ostri vrh, klinasto dno, socvetja v obliki metlice. Rastlina je večletna žita in od tretjega leta gojenja lahko na enem polju 15-20 let letno proizvede 10-15 t / ha / leto suhe biomase, kar ustreza 4-6 t / ha čiste celuloze.

IPCET SB RAS je razvil tehnologijo za proizvodnjo encimskih hidrolizatov iz miskantusa. Miscanthus predhodno kemično obdelamo z razredčenimi raztopinami kisline in / ali alkalije in nato encimsko hidrolizo. Preiskava procesa biosinteze BC na encimskem hidrolizatu lignoceluloznega materiala ovsenih lupin je pokazala, da mora biti encimski hidrolizat za uspešno mikrobiološko sintezo biološko dobre kakovosti.

V tem delu je bil lignocelulozni material (LCM) miskantusa izbran kot substrat za encimsko hidrolizo. LMC miskantusa dobimo z enostopenjsko obdelavo surovin z razredčeno raztopino dušikove kisline pri atmosferskem tlaku v standardni opremi. Dokazano je, da je encimski hidrolizat, pridobljen iz LMC miskantusa, biološko neškodljiv za biosintezo etanola in ne potrebuje dodatne obdelave, da bi ga osvobodil škodljivih nečistoč.

Cilj tega dela je bil preučiti postopek biosinteze BC na encimskem hidrolizatu LCM miscanthus in preučiti strukturo dobljenih vzorcev z infrardečo spektroskopijo. Treba je opozoriti, da je ta težava dvoumna, saj so proizvajalci BC zahtevnejši do sestave hranilnih medijev, zato podatkov o kakovosti medija za kvas ni mogoče ekstrapolirati na mikroorganizme, ki sintetizirajo celulozo.

Materiali in raziskovalne metode

LMC miskantusa je bil pridobljen z obdelavo z razredčeno raztopino dušikove kisline v poskusni proizvodnji IPCET SB RAS in je imel naslednjo sestavo (% glede na suho snov): masni delež v kislini netopnega lignina - 10,6, masni delež pepela - 4,8, masni delež celuloze po Kurschnerju - 86,7, masni delež pentozana - 7,9.

Encimsko hidrolizo miscanthus LCM smo izvedli v 11 L fermentorju v vodnem mediju pri 47 ± 2 ° C 72 ur z uporabo encimskih pripravkov Cellolux-A (0,04 g / g substrata) in Bruzheim BGX (0,1 ml / g substrata). ), je bila aktivna kislost s pomočjo amonijevega hidroksida in ortofosforne kisline vzdrževana na ravni 4,7 ± 0,2, začetna koncentracija substrata je bila 60 g / L, metoda je podrobneje opisana v delu.

Nastali encimski hidrolizat smo filtrirali iz ostankov substrata v vakuumu. Hidrolizat je bila prozorna rdeča tekočina s kislim vonjem, aktivna kislost 4,7 enot. pH. Skupna količina reducirajočih snovi (RS) je bila 49,0 g / l, od tega ksiloza 2,8 g / l. K filtriranemu LMC encimskemu hidrolizatu iz miskantusa smo dodali ohlajeno čajno infuzijo (1 L destilirane vode smo zavreli, dodali smo suh črni čaj, ekstrahirali 15 minut, ohladili in filtrirali). Hkrati je bil hranilni medij standardiziran glede vsebnosti RS od 20 do 25 g / l in vsebnosti ekstraktov čaja od 1,6 g / l do 4,8 g / l.

Kot producent za biosintezo BC je bila uporabljena simbiotska kultura Medusomyces gisevii Sa-12. Predhodno so kulturo prilagodili na preučevanem hranilnem mediju. Inokulum smo vnesli v hranilni medij v količini 10% prostornine hranilnega medija; gojenje je potekalo v statičnih pogojih pri 27 ° C 24 dni. Pogoji gojenja so bili izbrani na podlagi predhodnega dela.

Mikrobiološke kazalnike (število kvasovk in ocetnokislinskih bakterij) smo spremljali z mikroskopom B-150 OPTIKA. Rast BC filma smo ocenili z gravimetrično metodo (laboratorijska analitska tehtnica Explorer EX-224), raven aktivne kislosti smo spremljali z ionomerom (I-160 MI ionometer). Koncentracijo radioaktivnih snovi smo nadzorovali s spektrofotometrično metodo (spektrofotometer "UNICO-2804", ZDA) z uporabo dinitrosalicilnega reagenta, koncentracijo ksiloze smo določili s standardno metodo, ki temelji na tvorbi furfurala iz pentozanov.

Strukturo bakterijske celuloze smo raziskovali na infrardečem spektrofotometru "Infralum FT-801" v tabletah KBr.

Rezultati raziskav in njihova razprava

Sprememba števila celic kvasovk in ocetne kisline med gojenjem Medusomyces gisevii Sa-12 na encimskem hidrolizatu Miscanthus LCM je prikazana na sl. 1 je sprememba ravni aktivne kislosti med gojenjem Medusomyces gisevii Sa-12 prikazana na sl. 2.

Ugotovljeno je bilo, da je bila koncentracija kvasnih celic v hranilnem gojišču med gojenjem za velikost večja od koncentracije ocetno-kislinskih bakterij. Pri kvasu faze zamika niso opazili, povečanje koncentracije celic se je zgodilo od 0 do 12 dni, po 12 dneh je nastopila faza smrti. Pri ocetnokislinskih bakterijah so opazili fazo zaostanka, do 8 dni se je njihovo število povečalo, od 8 do 10 dni je število celic ostalo nespremenjeno, po 10 dneh je nastopila faza smrti.

Slika: 3. Odvisnost koncentracije radioaktivnih snovi in \u200b\u200bdonosa BC od trajanja gojenja

Med gojenjem simbiotske kulture Medusomyces gisevii v hranilnem mediju se zaradi delovanja zaščitnega mehanizma kopičijo vmesni produkti glikolize: ocetna, glukonske kisline, etanol in glicerol; posredno je njihovo kopičenje mogoče oceniti po spremembah pH. Začetna aktivna kislost hranilnega medija je bila 4,0; do šestega dne gojenja je vrednost pH padla na 3,8. Nadalje se je v procesu gojenja vrednost aktivne kislosti medija povečala na 5,9. Povečanje aktivne kislosti ni značilno za tega proizvajalca; vendar je bila podobna odvisnost opisana, ko je bil pridelovalec Gluconacetobacter xylinus CH001 gojen na kislem hidrolizatu miskantusa.

Na sl. 3 prikazuje odvisnost koncentracije RS in donosa BC od trajanja gojenja.

Konstanta hitrosti izrabe substrata se izračuna po formuli:

kjer je Ku.s. - konstanta izkoriščenosti substrata, dan-1; S1, S2 - koncentracija radioaktivnih snovi v začetnem in zadnjem trenutku; t1, t2 - začetni in končni trenutki časa, dnevi.

Slika: 4. IR spekter vzorca BC

Uporaba substrata se je zgodila v dveh obdobjih: od 0 do 6 dni gojenja je bila konstanta hitrosti izrabe substrata 0,234 dan-1, od 6 do 24 se je vrednost zmanjšala 12-krat in je znašala 0,020 dan-1. Hitra izraba radioaktivnih snovi od 0 do 6 dni je povezana z uživanjem substrata z mikroorganizmi in njihovim aktivnim razmnoževanjem. Od 6 do 24 dni se RV počasi porabi za vzdrževanje vitalne aktivnosti mikroorganizmov.

Hidrolizat miscanthus LCM je pretežno sestavljen iz glukoze, koncentracija ksiloze je bila v času nič 1,2 g / l. 7. dan gojenja je bila celotna koncentracija RS 4,9 g / L, količina ksiloze v hidrolizatu pa je ostala praktično nespremenjena in je znašala 0,8 g / L. Po 24 dneh gojenja je bila koncentracija RV v hranilnem mediju 3,4 g / l in ksiloze - 0,3 g / l.

Hitrost sinteze izdelka (bakterijska celuloza) se izračuna po formuli

kjer je Ks.p. - konstanta sinteze izdelka, 1. dan; C1, C2 - masa izdelka v začetnem in končnem trenutku; t1, t2 - začetni in končni trenutki časa, dnevi.

Prvi dan gojenja na površini hranilnega medija nismo opazili jasno izraženega BC gelskega filma. Drugi dan gojenja je nastal tanek BC gelni film. Glavno povečanje biomase se je zgodilo od 2 do 6 dni gojenja - proizvodnja BC se je povečala z 1,1% na 4,7%; konstanta hitrosti sinteze izdelka v tem obdobju je bila 0,363 dan-1. Od 6 do 10 dni se je donos BC povečal na 5,6%, konstanta hitrosti sinteze produkta v tem obdobju pa se je zmanjšala na 0,044 dan-1. Poleg tega se hitrost sinteze BC zmanjša in se nagiba k nič.

Od 10 do 24 dni se je donos BC zmanjšal na 1%, kar kaže na tekoče procese uničenja, to obdobje sovpada s fazo odmiranja kvasovk in ocetnokislinskih bakterij. Tako lahko v praksi začetek faze odmiranja mikroorganizmov služi kot merilo za konec procesa biosinteze BC.

Encimski hidrolizat miscanthus LCM ni ugodno hranilno gojišče za biosintezo BC, največji donos BC je bil 5,6%, kar je 1,6-krat manj kot pridelek BC na sintetičnem hranilnem mediju, ko se Medusomyces gisevii Sa-12 goji pod podobnimi pogoji - 9, 0%. Verjetno je to mogoče razložiti z metodo predobdelave surovine in prisotnostjo nečistoč v encimskem hidrolizatu miskantusa LCM, ki lahko zavirajo biosintezo BC. Tako dobra kakovost encimskega hidrolizata miskantusa LCM za biosintezo etanola ni zagotovilo dobre kakovosti za biosintezo BC, kar je posledica visokih zahtev glede kakovosti hranilnih medijev simbiotičnih proizvajalcev Medusomyces gisevii Sa-12 v primerjavi s Saccharomyces сerevisiae. Predvidevamo lahko, da je treba za uspešno biosintezo BC uporabiti čistejše substrate, na primer komercialno celulozo miskantusa.

Na sl. 4 prikazuje IR spekter vzorca BC, sintetiziranega na encimskem hidrolizatu LMC Miscanthus.

V infrardečem spektru vzorca BC je močan pas pri 3381 cm-1, kar kaže na raztezne vibracije skupin OH. Manj intenziven pas pri 2917 cm-1 je posledica razteznih vibracij skupin CH2, CH. V spektru BC pasovi v območju 2000-1500 cm-1 spadajo med upogibne vibracije OH skupin močno vezane vode. Šibki absorpcijski pasovi v območju: 1430-1370 cm-1 so posledica upogibnih vibracij skupin CH2; 1360-1320 cm-1 - upogibne vibracije skupin OH v CH2OH. Trakovi pri 1281 in 1235 cm-1 kažejo na upogibne vibracije skupin OH v alkoholih. Pas pri 1204 cm-1 kaže na upogibne vibracije skupin OH. Absorpcijski pasovi v območju 1000-1200 cm-1 so v glavnem posledica razteznih vibracij C-O-C in C-O v alkoholih. Tako je bilo z IR metodo potrjeno, da je BC, pridobljen na encimskem hidrolizatu LCM, čista spojina, ki vsebuje samo celulozo.

Preučevan je bil postopek biosinteze BC s simbiotsko kulturo Medusomyces gisevii Sa-12 na encimskem hidrolizatu Miscanthus LCM. Glavni izkoristek substrata se pojavi v 6 dneh gojenja, konstanta izkoriščenosti substrata je 0,236 dan-1. Ugotovljeno je bilo, da je število ocetnokislinskih bakterij med gojenjem za velikost manj kot kvasovk in po 10 dneh znaša 1,1 CFU / ml. Pokazalo se je, da lahko v praksi nastop smrtne faze simbiotskih mikroorganizmov služi kot merilo za konec procesa biosinteze, saj ta faza sovpada s postopkom uničenja BC. Pokazalo se je, da encimski hidrolizat miscanthus LCM ni benigni hranilni medij za biosintezo BC: donos BC na 10. dan gojenja je 5,6%, kar je 1,6-krat manj kot pridelek BC na sintetičnem hranilnem mediju, 24. dan pa se donos zmanjša do 1,0%, to je BC uniči. Infrardeča spektroskopija je pokazala, da je BC čista spojina, ki vsebuje samo celulozo.

Študijo je podprla donacija Ruske znanstvene fundacije (projekt št. 17-19-01054).

Bibliografska referenca

Gladysheva E.K. BIOSINTEZA BAKTERIJSKE CELULOZE NA ENZIMATIVNEM HIDROLIZATU LIGNOCELULOZNEGA MATERIALA MISCANTHUS // Temeljne raziskave. - 2017. - št. 9-2. - S. 290-294;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id\u003d41742 (datum dostopa: 13.12.2019). Opozarjamo vas na revije, ki jih je izdala "Akademija za naravoslovje"